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Aufgabe Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität:

Das Enzym Alkohol-DEHYDROGENASE (ADH) katalysiert die Oxidation von Fthanol zu Ethanal. Sein Cosubstrat ist \( \mathrm{NAD}^{\oplus} \), das bei dieser Reaktion \( 7 \mathrm{NADH}+\mathrm{H}^{\oplus} \) reduziert wird. Mit einem Photometer wird die Enzymaktivitat in mehreren Versuchsansâtzen mit unterschiedlichen Substratkonzentrationen gemessen. Man untersucht bei einer Wellenlange von \( 366 \mathrm{~nm} \), d. h., man miBt. die Konzentrationsânderung des Reaktionspartnors NAD \( { }^{\oplus} \). Die Enzymkonzentration in allen Ansatzen ist gleich.

Man kann die Änderung der Extinktion in allen Ansattzon in Abhangigkeit zur Zeit verfolgen. Die graphische Auftragung der Ergebnisse ergibt dann cine Schar von "Zeilumsatzkurven". Zur Bestimmung der Enzymkinetik genugt dic Messung der Extinktionsâderung in einom bestimmten zeitabschnitt, z. B. in elnor Minute.

cg (mmol/l)0.500.833.3316.6
Δ E/min0.720.901.311.54

\( C_{g}= \) Konzentration des Substrats
\( \Delta \mathrm{E}= \) Extinktionsdifferenz

Aufgaben:

a) Zeichnen Sie die Schar der Zeitumsatzkurven für die verschiedenen \( \mathrm{c}_{\mathrm{s}} \)-Ansätze! Welcher Verlauf der Kurven ist in den weiteren Minuten der Reaktion zu erwarten. Deuten Sie den wahrscheinlichen Kurvenverlauf gestrichelt an!

b) Beschreiben Sie in einem kleinen Text die Erstellung eines Michaels-Menten-Diagramms bei gegebenen Zeitumsatzkurven.

c) Bestimmen Sie sowohl aus dem Michaelis-Menten-Diagramm, als auch aus der Lineveawer-Burk-Darstellung die Michaelis-Menten-Konstante \( K_{M} \).

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Aufgaben zum Thema Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität

Aufgabe a) Zeichnen der Zeitumsatzkurven für verschiedene \( \mathrm{c}_{\mathrm{s}} \)-Ansätze

Im Rahmen dieser Aufgabenerklärung kann ich keine graphischen Darstellungen erstellen, aber ich kann erklären, wie die Kurven aussehen würden und was zu erwarten ist.

Für die verschiedenen Substratkonzentrationen \( \mathrm{c}_{\mathrm{g}} \) wurden die Änderungen der Extinktion \( \Delta \mathrm{E} \) pro Minute gemessen. Je höher die Konzentration des Substrats, desto schneller scheint die Reaktion stattzufinden, was sich in einer größeren Änderung der Extinktion ausdrückt. Die Zeitumsatzkurven stellen die Änderung der Extinktion (\( \Delta \mathrm{E} \)) über die Zeit dar.

Typischerweise beginnen solche Kurven nahe Null und steigen dann in Abhängigkeit von der Substratkonzentration. Für niedrige \( \mathrm{c}_{\mathrm{g}} \)-Werte steigen die Kurven langsamer, während sie für hohe \( \mathrm{c}_{\mathrm{g}} \)-Werte schneller steigen. Allerdings nähern sich alle Kurven einem bestimmten Punkt einem Plateau an, was darauf hinweist, dass die Reaktion eine maximale Geschwindigkeit erreicht hat. Der Grund dafür ist, dass das Enzym Alkohol-Dehydrogenase in seiner maximalen Kapazität arbeitet und nicht mehr Substrat pro Zeiteinheit umsetzen kann.

Für den weiteren Minutesverlauf der Reaktion, nachdem die anfänglichen Messungen durchgeführt wurden, kann man erwarten, dass die Kurven weiter ansteigen, jedoch wird der Anstieg langsamer, bis er schließlich ganz aufhört und die Kurven in eine horizontale Linie übergehen (Plateau). D.h., die gestrichelten Fortführungen der Kurven würden anzeigen, dass kein weiterer Anstieg der Extinktion erfolgt, was auf einen vollständigen Verbrauch des Substrats oder eine Sättigung des Enzyms hinweisen könnte.

Aufgabe b) Erstellung eines Michaelis-Menten-Diagramms

Um ein Michaelis-Menten-Diagramm bei gegebenen Zeitumsatzkurven zu erstellen, zeichnet man die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion \(v_0\) gegen die Substratkonzentration \( \mathrm{c}_{\mathrm{g}} \). Die Anfangsgeschwindigkeit kann aus der Steigung der Extinktionsänderung in den ersten Momenten der Reaktion abgelesen werden.

1. Bestimmen Sie die Anfangsgeschwindigkeiten für jede Substratkonzentration: Dies beinhaltet die Auswertung der Steigung der Zeitumsatzkurven zu Beginn der Reaktion.

2. Tragen Sie die Anfangsgeschwindigkeiten (\(v_0\)) auf der y-Achse des Diagramms gegen die jeweiligen Substratkonzentrationen (\( \mathrm{c}_{\mathrm{g}} \)) auf der x-Achse auf.

3. Zeichnen Sie eine Kurve, die die Punkte bestmöglich miteinander verbindet.

Im Michaelis-Menten-Diagramm steigt die Reaktionsgeschwindigkeit \(v_0\) zuerst mit zunehmender Substratkonzentration stark an. Jedoch nähert sie sich einem Punkt, ab dem weitere Erhöhungen der Substratkonzentration nur noch geringe Zuwächse der Reaktionsgeschwindigkeit zur Folge haben, bis sie ein Maximum (\(V_{max}\)) erreicht. Dies spiegelt die Sättigung des Enzyms mit dem Substrat wider.

Aufgabe c) Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante \(K_{M}\)

Aus dem Michaelis-Menten-Diagramm:
Die Michaelis-Menten-Konstante \(K_{M}\) ist die Substratkonzentration, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte von \(V_{max}\) erreicht. Man sucht im Diagramm den Punkt, an dem die Reaktionsgeschwindigkeit halb so groß wie \(V_{max}\) ist, und liest die entsprechende Substratkonzentration auf der x-Achse ab.

Aus der Lineweaver-Burk-Darstellung:
Die Linearisierung des Michaelis-Menten-Diagramms durch die Lineweaver-Burk-Darstellung, in der \(1/v\) gegen \(1/[S]\) aufgetragen wird, ermöglicht eine einfachere Bestimmung der \(K_M\)- und \(V_{max}\)-Werte durch lineare Regression. In dieser Auftragung ist \(K_{M}\) der Schnittpunkt der Geraden mit der x-Achse, wenn \(1/v = 0\). Ermitteln Sie diesen Wert und nehmen dessen Reziproke, um \(K_{M}\) zu finden.

Beide Methoden ermöglichen die Bestimmung von \(K_{M}\), allerdings ist die Lineweaver-Burk-Darstellung insbesondere bei experimentellen Daten vorteilhaft, weil sie eine grafische Möglichkeit bietet, sowohl \(K_{M}\) als auch \(V_{max}\) direkt aus der Steigung und den Schnittpunkten der Geraden abzulesen.
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